啤酒糟固态发酵产β—葡萄糖苷酶的研究

【中国国际啤酒网】啤酒糟是啤酒工业中的主要副产物，是以大麦为原料，经发酵提取籽实中可溶性碳水化合物后的残渣。在国内，啤酒糟主要作为饲料被直接使用，利用效率很低。啤酒糟中含有丰富的蛋白质、脂肪、膳食纤维，氨基酸、糖类和多种微量元素，是良好的天然培养基，不仅可以发酵生产一些蛋白饲料，同时也可以用于工业酶制剂的生产。啤酒糟的再利用，可以增加啤酒工业的附加值，降低其生产成本。

β—葡萄糖苷酶又称β—D—葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它可以水解糖链末端非还原性的β—D—葡萄糖苷键。β—葡萄糖苷酶是纤维素酶的主要组成成分，直接影响着纤维素酶的降解能力。

此外，β—葡萄糖苷酶在食品行业中也有着广泛的应用，如作为水果和茶叶的风味酶，水解大豆异黄酮甙元等。β—葡萄糖苷酶存在于自然界很多植物中，也存在于酵母、曲霉属、木霉属及一些细菌中。黑曲霉是公认安全的微生物之一, 在纤维物质的诱导下，黑曲霉可产生胞外β—葡萄糖苷酶。

笔者研究了黑曲霉固态发酵啤酒糟产β—葡萄糖苷酶的工艺条件，同时探讨了β—葡萄糖苷酶合成的动力学机制，望能为啤酒糟的再利用提供一定数据依据。

1 材料和方法

1.1 菌种

黑曲霉购于广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。

1.2 试剂和设备

1.2.1 主要试剂

啤酒糟由蚌埠学院生物与食品工程系啤酒发酵实验室提供；

水杨苷（进口分装）、微晶纤维素（进口分装）、羧甲基纤维素钠（CMC）、 3， 5—二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、苯酚。

1.2.2 主要设备

752分光光度仪（上海菁华科技仪器有限公司）、DH Z—D冷冻恒温振荡器（江苏太仓市实验设备厂）、SFAT—8000固态发酵罐（常州新区三环生物工程成套设备有限公司）。

1.3 培养基

斜面培养基：pDA培养基；

发酵培养基：啤酒糟5g置于500ml 三角瓶中，用基本培养液调初始含水量，121℃灭菌20min。

1.4 试验方法

1.4.1 粗酶液的制备

黑曲霉在无菌条件下接入斜面培养基，30℃培养72h。每100ml 无菌水接入1环孢子配置种子悬浮液( 1.15×106 /ml )。按一定料液比将种子悬浮液接入灭菌后的发酵培养基中，培养96h。用100ml去离子水浸提培养基，搅拌1h，抽滤，在3000r/min条件下离心15min，收集上清液，即为粗酶液。

1.4.2 单因素分析

在其他条件不变的情况下，分别测定不同温度、料液比和接种量对β—葡萄糖苷酶酶活的影响。

1.4.3 正交分析

利用L9( 34 )正交试验优化β—葡萄糖苷酶的发酵条件。

1.4.4 动力学研究

发酵过程中，每隔24h分别测定发酵培养基中Cx 酶、β—葡萄糖苷酶和C1酶的活性，分析β—葡萄糖苷酶酶活随时间的变化情况。

1.5 酶活力的测定

1.5.1 β—葡萄糖苷酶活力的测定。取4支洗净烘干的10ml具塞刻度试管， 编号后各加入1.5ml0.5%水杨酸苷柠檬酸缓冲液，向1号试管中加入1.5mlDNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4支试管同时在50℃水浴中预热5min—10min，再各加入酶液0.5ml，50℃水浴中保温30min，取出后立即分别向2、3 和4号试管中加入1.5ml DNS 溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至10ml，充分混匀。

以1号试管溶液为空白对照调零点，测定2、3和4号试管液的吸光度值并记录结果。定义在测定条件下，1min内水解水杨酸苷生成1μmol葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位（U）。

1.5.2 葡萄糖内切酶（CX）活力的测定 以羧甲基纤维素钠为底物，方法同上。

1.5.3 葡萄糖外切酶（C1）活力的测定 以微晶纤维素为底物，方法同上。

1.5.4 还原糖的测定 采用DNS（3，5—二硝基水杨酸）法。

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